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      出口禽肉中莫能菌素殘留量檢驗方法生物自顯影法 SN 0296一93

      2008-12-20 [2332]

      中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

         出口禽肉中莫能菌素殘留量檢驗方法
               生物自顯影法 SN 029693
      Method for the determination of monensin
      residues in poultry meat for export
      ?Bioautography method
      ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
      1
      主題內(nèi)容與適用范圍
        本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口禽肉中莫能菌素殘留量的抽樣、制樣和生物自顯影測定法。
        本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口凍雞中莫能菌素殘留量的檢驗。
      2
       抽樣和制樣
      2.1
       檢驗批
        以不超過2500件商品為一檢驗批。
        同一檢驗批的商品應(yīng)具有相同特征,如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地、規(guī)格和等級等。
      2.2
       抽樣數(shù)量
           批量,件            zui低抽樣數(shù),
              125                1
             26100                5
             101250 10
             251500 15
             5011000               17
            10012500               20
      2.3
       抽樣方法
        按2.2規(guī)定的抽樣件數(shù)隨機抽取,逐件開啟。每件至少取一袋作為原始樣品,原始樣
      品總量不少于2kg,放入清潔容器內(nèi),加封后標(biāo)明標(biāo)記,及時送交實驗室。
      2.4
       樣品制備
        從每袋原始樣品中取出部分有代表性樣品,將可食部分放入高速組織搗碎機中搗碎均
      ,充分混勻,用四分法縮分出不少于1kg試樣。裝入清潔容器內(nèi),加封后標(biāo)明標(biāo)記。
      2.5
       樣品保存
        將試樣于?18冷凍保存。
        注:在抽樣及制樣過程中,必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。
      3
       測定方法
      3.1
       方法提要
        用甲醇提取肉樣中莫能菌素,經(jīng)四氯化碳萃取后濃縮至干,以甲醇溶解殘留物,用薄
      層分離,再用生物自顯影法測定。
      3.2
       設(shè)備和材料
      3.2.1
       微量注射器:50 μL
      3.2.2
       薄層板:硅膠,Q/YT 257?85SG,5cm×20cm,使用前110活化2h。
      3.2.3
       展開缸:240mm×57mm×32mm。
      3.2.4
       游標(biāo)卡尺:測量范圍0200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈測量儀測量。
      3.2.5
       離心機:轉(zhuǎn)速3000 r/min
      3.2.6
       旋轉(zhuǎn)濃縮器。
      3.2.7
       恒溫培養(yǎng)箱:37±1
      3.2.8
       高壓滅菌器。
      3.2.9
       長方形培養(yǎng)皿:20cm×10cm×5cm。
      3.2.10
      均質(zhì)器:帶均質(zhì)杯250mL
      3.3
       試劑和培養(yǎng)基
      3.3.1
       試劑
      3.3.1.1
       甲醇:分析純。
      3.3.1.2
       四氯化碳:分析純。
      3.3.1.3
      乙酸乙酯: 分析純。
      3.3.1.4
       莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品: 960μg(效價)/mg(中國獸藥監(jiān)察所提供)。
      3.3.1.5
       試驗菌種:枯草桿菌(Bacillus subtilis), 菌種號ATCC 6633(衛(wèi)生部藥品生物
      制品檢定所提供)。
      3.3.2
       培養(yǎng)基
      3.3.2.1
       菌種用培養(yǎng)基(見附錄A A1)
      3.3.2.2
       生物自顯影用培養(yǎng)基(見附錄AA2)。
      3.3.2.3
       肉湯培養(yǎng)基(見附錄AA3)。
      3.4
       測定步驟
      3.4.1
      工作液制備
      3.4.1.1
       莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)貯備液
        準(zhǔn)確稱取適量的莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解配制成濃度為500μg(效價)/mL的莫能
      菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后于冰箱中保存,一周內(nèi)使用。
      3.4.1.2
       莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液
        吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用甲醇分別稀釋成2,3,4,5,1015μg(效價)/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作
      標(biāo)準(zhǔn)液。以上稀釋液均須當(dāng)日配制。
      3.4.1.3
       菌種培養(yǎng)及芽胞菌懸浮液制備
        將菌種安瓿瓶的上部消毒后敲碎,加入少量肉湯培養(yǎng)基,使其溶解并移至肉湯管中混
      勻。置37±1溫箱中培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)物接種于菌種培養(yǎng)基中,置于37±1培養(yǎng)一周,
      鏡檢含芽胞菌數(shù)達(dá)85%以上, 便可制備芽胞懸浮液。
        用適量滅菌生理鹽水沖洗菌苔,然后將該菌液轉(zhuǎn)移至離心管中,充分搖勻后,3000
      r /min
      離心30min, 棄去上清液,再加入同樣量的滅菌生理鹽水重復(fù)離心一次。棄去上清
      ,再加入適量滅菌生理鹽水,搖勻后于65水浴中加熱30min,然后,1000 r/min
      5min, 取上清液并轉(zhuǎn)入滅菌試管中,即為芽胞菌懸浮液,置于冰箱中保存,可使用一個
      月。
      3.4.2
       試液制備:準(zhǔn)確稱取絞碎試樣10g(0.1g)于均質(zhì)杯中,加入20mL甲醇,均質(zhì)
      2min
      ,移入離心管中,3000 r/min離心20min。取其上清液15mL,轉(zhuǎn)入盛有5mL蒸餾水
      250mL分液漏斗中,混合后加入10 mL四氯化碳,充分振搖,靜置分層,放出四氯化碳層
      150 mL茄形瓶中。用四氯化碳再重復(fù)提取兩次, 合并四氯化碳至上述茄形瓶中, 50
      60
      水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至干,加入0.5mL甲醇溶解殘留物供TLC實驗用。此樣液中相
      當(dāng)于禽肉試樣濃度為15g/mL
      3.4.3
       測定
      3.4.3.1
      生物自顯影
        將每個樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液分別點在四塊薄層板上,先于每塊薄層板下端2cm處劃一條基
      ,然后在這條基線上分別點20μL試液和3μg(效價)/mL莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液,試液和標(biāo)準(zhǔn)
      溶液點相距2.5cm。在展開缸中用乙酸乙酯進行展開,直至溶劑前沿線距板頂端1.5cm處為
      ,取出薄層板,風(fēng)干后備培養(yǎng)用。
        將薄層板水平置于高壓滅菌的長方形培養(yǎng)皿中,無菌操作將已熔化并冷卻至5055
      的生物自顯影用培養(yǎng)基均勻地噴在其表面上,然后用10mL上述接種芽胞菌懸液的培養(yǎng)基鋪
      滿整個薄層板,保持水平,待其凝固,37±1培養(yǎng)18 h。
      3.4.3.2
       對照試驗
        除不加試樣外,按上述測定步驟進行。
      3.5
       結(jié)果計算和表述
        經(jīng)過培養(yǎng)后,在薄層板上與莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)液產(chǎn)生抑菌圈的Rf(0.38)相同位置上,
      顯現(xiàn)抑菌圈者即為陽性。
        當(dāng)樣品判定為陽性時,測量四塊薄層板上的試液及標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的抑菌圈直徑,分別
      計算出平均值。當(dāng)每組四個直徑值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不超過5%,并且試液的抑菌
      圈直徑與標(biāo)準(zhǔn)溶液(20μL)的抑菌圈直徑近似(直徑相差不超過±1mm),則其樣品中莫能菌
      素含量按下式計算:
      c
      X
      ──
      m
      式中:X??樣品中莫能菌素的含量,mg/kg;
         c??試驗中所用的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,μg/mL;
         m??zui終試液所代表的禽肉試樣的濃度,g/mL。
      4
       測定低限、回收率
      4.1
       測定低限
        本方法測定低限為0.20mg(效價)/kg。
      4.2
       回收率
        回收率的實驗數(shù)據(jù):莫能菌素濃度在0.200.67mg(效價)/kg范圍內(nèi),回收率為81%
      100%
      。

      附 錄 A 
                   培養(yǎng)基成分及制備方法
                       (補充件)
      A1
       菌種用培養(yǎng)基
           蛋白胨 10.0g
           牛肉浸膏 5.0g
           氯化鈉          2.5g
           瓊脂 15.0g
           蒸餾水 1000mL
        將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使其
      滅菌后pH6.5±0.1,分裝于試管或克氏瓶內(nèi),121 15min高壓滅菌,滅菌后制備成
      所需斜面?zhèn)溆谩?/span>
      A2
       生物自顯影用培養(yǎng)基
           蛋白胨 10.0g
           酵母浸膏         2.5g
           葡萄糖 10.0g
           瓊脂 15.0g
           蒸餾水 1000mL
        將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使其
      滅菌后pH6.0±0.1,分裝于錐形瓶內(nèi),12115 min高壓滅菌,備用。
      A3
       肉湯培養(yǎng)基
           蛋白胨 10.0g
           牛肉浸膏         5.0g
           氯化鈉          2.5g
           蒸餾水 1000mL
        將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使
      其滅菌后pH7.0±0.1,分裝于試管中,12115min高壓滅菌。

      B 
                      檢驗程序圖
                       (補充件)
      試樣(10.0g) 試驗菌培養(yǎng)

      于均質(zhì)杯內(nèi)加入
      20 mL甲醇

      均質(zhì)2 min
      移入離心管

      離心20 min(3000r/min) 菌液制備

      取上清液(15 mL)
      轉(zhuǎn)入盛有5mL蒸餾生物自顯影用培養(yǎng)基
      水的分液漏斗中


      加入四氯化碳(10 mL)
      充分振搖后分取四氯化碳層
      轉(zhuǎn)入茄形瓶中, 再重復(fù)兩次

      合并入上述茄形瓶中

        蒸干

      0.5mL甲醇溶解

      層析

      ┗━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━┛

      培養(yǎng)


      檢定


      結(jié)果和表述

      ━━━━━━━━━━━
      附加說明:
        本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國國家進出口商品檢驗局提出。
        本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國天津進出口商品檢驗局負(fù)責(zé)起草。
        本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人袁而森、王素琴、李劍影。
        本標(biāo)準(zhǔn)等同采用日本厚生省檢驗方法:畜水產(chǎn)食品中の殘留物質(zhì)檢查法(1990)
      ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
      中華人民共和國國家進出口商品檢驗局1993-12-28批準(zhǔn) 1994-05-01實施

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